碱裂解法提取质粒三种溶液的作用

2024-07-09 06:38:44

溶液Ⅰ：葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNaseA消化RNA。

溶液Ⅱ

此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点：

比较好，时间预测（数据为往年仅供参考）不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂；

第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。

溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。

因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

2M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了，所以碱处理的时间预测（数据为往年仅供参考）要短，而且不得激烈振荡，不然***得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。

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